Главная страница
Навигация по странице:

  • Термостабильные бактерии Termus Aquaticus

  • Современный амплификатор Corbett (вид 1)

  • Общая схема амплификации изучаемого фрагмента ДНК

  • Расширение возможностей полимеразной цепной реакции – использование метода Real-time PCR (ПЦР с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме реального времени)

  • Real-time PCR

  • СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

  • ПЦР. Полимеразная цепная реакция


    Скачать 6.22 Mb.
    НазваниеПолимеразная цепная реакция
    Дата05.05.2019
    Размер6.22 Mb.
    Формат файлаpptx
    Имя файлаПЦР.pptx
    ТипДокументы
    #56639

    Полимеразная цепная реакция


    ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции и реакционный буфер.

    В 1983 году Кэри Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

    Праймеры – это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20 – 30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно используют 2 праймера, которые комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матицы соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов ДНК.

    Термостабильные бактерии Termus Aquaticus

    В один цикл ПЦР включается 3 этапа:
    • Денатурация – исходная смесь нагревается до 94°С, при этом нити ДНК расходятся;
    • Отжиг – на этом этапе Т реакционной смеси снижается до 52 – 60°С и происходит комплементарное связывание праймеров с нитями матричной ДНК;
    • Полимеризация, в ходе которой Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'-конца) и синтез новых цепей ДНК. Т смеси для проявления оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72°С.

    Современный амплификатор Corbett (вид 1)

    Эти этапы повторяются многократно в приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз.

    Общая схема амплификации изучаемого фрагмента ДНК

    Широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции, даже если в пробе содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, венерических заболеваний и т.д.

    Этот метод имеет большое значение для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. Определение «вирусной нагрузки» позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.
    • Расширение возможностей полимеразной цепной реакции – использование метода Real-time PCR (ПЦР с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме реального времени)
    • Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации

    Преимущества ПЦР в реальном времени

    • все операции проводятся в одной пробирке;
    • - исключается риск контаминации ПЦР-смеси и продуктов;

    • быстрота анализа;
    • - возможность автоматизации

    Приборы для Real-time PCR


    Преимущества метода ПЦР:
    • среди методов диагностики инфекционных возбудителей ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности и специфичности;
    • возможность использования разнообразного клинического материала;
    • возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования;
    • повышенная стабильность при транспортировке, т.к. нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде;
    • скорость проведения анализа (иногда < 24 ч.);
    • точное определение этиологии инфекции;
    • определение количества возбудителя, это особенно актуально для условно-патогенных микроорганизмов, которые вызывают патологию только при определенных условиях;
    • проведение контроля за течением инфекционного процесса.

    С другой стороны, метод ПЦР, как и любой другой тест молекулярной диагностики, во многом зависит от правильности забора и транспортировки исследуемого материала.

    СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!



    написать администратору сайта